磷酸化蛋白作为细胞信号转导的重要调节因子，其研究对揭示生命机制和疾病根源具有不可或缺的意义。然而，磷酸化蛋白的低丰度及其动态变化特点使得在Western Blot(WB)显影成像过程中常常面临以下挑战：条带微弱、无条带、高背景以及杂带频繁等。本文总结了磷酸化蛋白Western Blot实验的优化建议，以帮助研究人员提高实验的成功率。

什么是磷酸化蛋白？

磷酸化蛋白是指在激酶催化下进行磷酸化修饰的蛋白质。这种修饰如同一个“开关”，能够调控蛋白质的活性、位置和相互作用，从而影响细胞的增殖、分化、代谢等几乎所有生命活动。

磷酸化蛋白的研究意义

磷酸化蛋白的研究广泛，主要涵盖以下领域：

• 细胞信号通路：探讨细胞如何通过磷酸化响应外部刺激。
• 疾病机制：磷酸化异常与多种疾病密切相关，如癌症、神经退行性疾病和糖尿病。
• 药物开发：磷酸化蛋白是重要的药物靶点，其调控机制的研究有助于新药的开发。

如何优化磷酸化蛋白的WB检测？

为了提高Western Blot检测磷酸化蛋白的成功率，我们建议从以下几个方面进行优化：

1. 通过有效的样本制备提高目的蛋白丰度

优质的蛋白质样品是WB实验的基础。针对低丰度蛋白（如磷酸化蛋白、膜蛋白、核蛋白），建议根据目标蛋白的定位，采用特定的蛋白提取方法进行富集。选择合适的裂解液是关键，若目标蛋白为核蛋白，则不宜使用NP-40等温和的裂解液。

2. 有效分离蛋白样品，提高转印效率

为避免蛋白在电泳过程中降解，选择合适的凝胶和电泳缓冲液至关重要。中性pH和温和的样本处理方案可以使蛋白样品在温和的非酸性条件下保持完整性，减少蛋白修饰。这对于低丰度蛋白的分离尤为重要。电泳后的蛋白需转印到膜材质上，以便后续的抗体检测。相较于NC膜，PVDF膜在性能上更为出色，是公认的WB专用膜。此外，膜上无蛋白部分需使用适当试剂封闭，以降低背景干扰。

3. 选择优质抗体

选用高亲和性和高特异性的抗体是低丰度WB检测的关键。需要注意的是，抗体浓度的高低并不一定代表结果的好坏，合理的抗体浓度搭配和样本稀释才能保证良好的ECL显色。在某些情况下，使用多克隆抗体可识别多个表位，从而提高检测灵敏度，便于检出丰度较低的蛋白。

4. 选择高灵敏度ECL发光液

ECL发光液在WB实验中至关重要，选择高灵敏度的发光液不仅可以获得清晰的目的条带，还能节省时间及昂贵的抗体成本。

5. 选择高灵敏度、宽定量范围的成像系统

低丰度蛋白的检测需要宽定量范围的成像方式，以获取更可靠的数据，并为后续的半定量分析提供支持。强烈推荐尊龙凯时推出的ChemiScope S7超高灵敏化学发光成像仪，其采用光子无损式成像技术，能够最大程度减少光信号损失，提供高灵敏度和低噪声的成像效果，让所有目标条带清晰可见，同时背景干净。

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