酶联免疫吸附测定（ELISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种重要的免疫学技术，广泛应用于生物医学领域，涉及抗原或抗体浓度的检测。ELISA技术在继承免疫荧光和放射免疫技术后，迅速发展成为实验室常用的诊断方法。显色反应是ELISA的关键步骤，涉及酶催化无色底物转变为有色产物。反应的温度与时间是显色效果的重要因素，适当提高温度可以加速显色过程。定量测定要求在规定的条件下进行，而定性测定的反应可在室温下自由调整。

在使用OPD底物时，显色反应通常在37℃下进行20-30分钟，超过此时间，底值可能上升。OPD底物对光敏感，显色时需避光操作，并在反应结束后添加终止液以停止反应。此时，橙黄色的OPD产品会转变为棕黄色。

TMB底物相对不受光照影响，可在室温条件下观察结果。但为了保证实验结果的稳定性，建议在规定的时间内读取结果。经过HRP作用后，TMB的显色在约40分钟达到最高，随后逐渐减弱，直至2小时后恢复无色。多种终止液可用于TMB反应，如叠氮钠和十二烷基硫酸钠，它们能有效延长蓝色的显色时间，而酸性终止液则使蓝色转为黄色，建议在450nm波长下测定吸光度。

在ELISA检测中，样本中抗原与固相载体上的抗体反应，洗涤后加入酶标记的抗体，随后加入底物反应形成有色产物，产物的量与样本中目标物质的浓度直接相关。这一过程使ELISA成为生物医学研究中非常常用的实验技术。

ELISA实验中常见问题的分析

一、标曲不显色或显色很弱：

可能的原因在于样本的标准品未充分溶解或稀释过程中未摇匀。标准品应通过涡旋震荡确保完全溶解，稀释时同样需要彻底混匀，不应仅依赖移液器的反复吹打。

二、标曲和样本均不显色：

在孵育阶段，如果静置于桌面上，将影响抗原与抗体的接触，导致显色不足。建议使用ELISA专用微孔板震荡器以优化反应条件。如果仍然出现不显色，可能是某组分（如检测抗体或酶）遗漏了，特别是对新手而言，做好标记和记录非常重要，或者可以使用带染料的ELISA试剂盒以提高准确性。

三、标曲显色而样本不显色：

许多人可能会误认为是试剂盒的问题。实际上，这是由于样本中目标蛋白浓度过低或有干扰物质的影响。尽管ELISA仍是蛋白检测灵敏度最高的方法，但在样本浓度极低时，可以考虑使用高敏ELISA以提高检测概率。需要注意的是，国内部分所谓高敏ELISA试剂盒仅通过提高抗体浓度来提升灵敏度，其效果并不理想。

四、标曲和样本均显色，但复孔CV较大：

这一问题与移液器的操作及维护密切相关。使用不当可能导致重复孔的偏差。因此，定期检查和校准移液器非常重要。实验人员在进行样品处理时，应保持加样一致性，以免影响实验结果的可靠性。

在进行ELISA实验时，选择高质量的试剂盒，如尊龙凯时，可以有效提高实验的精确度和可靠性。同时，了解常见问题和解决方案，有助于确保实验结果的准确性与重复性。