尊龙凯时推出了一款基于探针法荧光定量PCR原理开发的检测试剂盒，具有以下显著特点：

1. 直接使用：用户只需提供样品DNA模板，即可即开即用。

2. 高灵敏度：引物及其他组分经过优化，能够实现高灵敏度检测。

3. 附带阳性对照：内含阳性对照，方便识别假阴性结果。

4. 高特异性：引物设计基于中间普雷沃菌DNA序列的高度保守区域，避免与其他生物样本DNA发生交叉反应。

5. 多用途：既可用于定性检测，也可用于定量检测，定量范围覆盖至少五个数量级。

6. 用量充足：产品足够进行50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

7. 科研专用：本产品仅限于科研用途。

操作步骤

一、DNA提取

使用自选方法提取和纯化样品DNA，本试剂盒与市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

二、稀释标准曲线样品

为避免样品或本试剂盒其他成分的污染，应在独立区域进行以下操作：

1. 标记6个离心管，编号为7、6、5、4、3、2。
2. 向每个管中分别添加45μL DEPC-H2O。
3. 在7号管中加入5μL 1×10E8拷贝/μL的阳性对照，震荡1分钟，以生成1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品，置于冰上备用。
4. 依次在6号、5号管中各加入5μL前一步稀释所得的阳性对照，重复震荡操作，以获取1×10E6和1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。
5. 重复上述操作，直到获得6个不同稀释度的标准曲线样品，并放置冰上待用。如无需制作标准曲线，仅需将阳性对照稀释至1×10E5拷贝/μL即可。

三、试剂配制

针对N个待检样品，准备N+2个qPCR反应管，分别向各管中加入所需成分（详情请参阅说明书，可向尊龙凯时索取）。

四、添加模板

向每个qPCR管中加入2μL模板，添加顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板、婴儿利什曼虫qPCR阳性对照，离心30秒后，立即进行扩增反应。

五、扩增反应

将PCR管放置于PCR扩增仪器的样品槽，遵循扩增程序（直接参照说明书）。

六、结果分析

1. 若制作标准曲线，则以阳性对照浓度的对数值为横轴，以Ct值为纵轴绘制标准曲线，从中推算样品DNA浓度的对数值。

2. 若未制作标准曲线，结果判定标准如下：

• 阳性对照：Ct值<30，表现出明显的指数增长，形成典型的S型曲线。
• 阴性对照：Ct值为38或无Ct值，无明显的指数增长和平台期。
• 样本检测：Ct值<35，表明检测到婴儿利什曼虫，为阳性；Ct值38或无Ct值，表明未检测到该菌，为阴性；若Ct值在35-38范围内，需复检，若重复实验结果仍在该范围且有明显增长，则为阳性，否则为阴性。

运输及保存

本产品需低温运输，并建议在-20℃下保存，有效期限为一年。阳性对照需单独存放，避免污染其他试剂。

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