在现代生命科学领域，蛋白质的一级结构——即其氨基酸序列——不再被看作是静态的分子代码。它不仅决定了蛋白质的空间构象和功能特性，还深刻影响着细胞行为、信号通路的动态变化，甚至对进化路径与疾病机制形成重要影响。因此，获取蛋白质的准确序列成为了解其生物学功能与作用机制的起点。

与传统的“蛋白鉴定”相比，蛋白测序（Protein Sequencing）关注的是完整且连续的氨基酸信息，这对于解析未知蛋白、识别序列突变、确认药物蛋白一致性、追踪翻译后修饰等科研任务尤为关键。在生物药物开发、个性化医学、结构生物学及抗体工程等高精度领域，蛋白测序技术的精细化能力日益成为研究和应用决策的重要技术杠杆。

一、蛋白测序与蛋白鉴定的区别

在蛋白质组学的研究中，“测序”和“鉴定”等术语常被交替使用，导致了术语误用、技术选择失误，甚至研究假设的混淆。从定义上看，蛋白测序是解析蛋白质氨基酸序列的过程，旨在重建其一级结构的连续排列，通常以N端到C端的方向表述全部或部分氨基酸序列，目标是获取“序列本体”，而非仅仅判断蛋白的“存在性”或“类别归属”。

相比之下，蛋白鉴定（Protein Identification）依赖于质谱与数据库匹配，以确定某一肽段是否“属于”某个已知蛋白。它是分类性的“归属判断”，而不是逐位点的信息重建。

二、蛋白测序技术的演化

1. Edman降解：高精度线性识别的开端

Edman降解是由Pehr Edman于20世纪50年代建立的，是蛋白质序列解析的首次化学实现。这一方法基于苯异硫氰酸（PITC）对N端氨基酸的专一性反应，通过顺序标记与切除，实现线性序列的重建。尽管Edman法具有高精度的氨基酸识别能力，但它仅适用于具有游离N端的纯化样品，且序列长度通常不超过30-50个残基。

2. Bottom-up质谱策略：高通量测序的技术中心

质谱技术的引入标志着蛋白测序发展中的重要转折点。Bottom-up策略通过特异性蛋白酶（如胰蛋白酶）将蛋白质酶解为短肽段，借助LC-MS/MS对这些肽段进行检测，并通过数据库比对重建蛋白质序列。该策略具备良好的通量与适配性，成为广泛应用的蛋白测序方法。

3. Top-down质谱策略：整分子结构识别的深入拓展

Top-down测序策略直接将完整蛋白质送入高分辨率质谱系统，高能碎裂后解析其多级碎片离子，实现对一级结构的识别。这种方法特别适用于蛋白质翻译后修饰的识别和生物药质量属性评估，但对质谱平台的分辨率和样本纯度有很高的要求。

4. 单分子蛋白测序的崛起

相较于传统质谱测序策略，单分子蛋白测序（Single-Molecule Protein Sequencing, SMPS）能够直接读取氨基酸顺序，克服了分辨歧义和修饰缺失的局限性。通过纳米孔测序和荧光法测序等新兴方法，SMPS为蛋白质研究打开了新的视野。

蛋白测序的各类技术路径，从化学降解到质谱分析，再到单分子水平的直接读取，形成了一套信息获取体系。这些方法并非相互替代，而是在不同研究目标和样本条件下，实现结构精确性、序列覆盖率与修饰还原度之间的平衡。

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